使用Transwell板构建体外血脑屏障模型的实验步骤
使用Transwell板构建体外血脑屏障模型的实验步骤
一、材料与试剂
- 细胞系：bEnd.3小鼠脑微血管内皮细胞
- 培养基：DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清（FBS）+ 1%青霉素/链霉素
- Transwell板：孔径0.4μm，PET膜（洁特）
- 消化液：0.25%胰蛋白酶-EDTA
- TEER测量仪：金工鸿泰RE1600上皮电压电阻仪
- 其他：PBS、75%酒精、细胞计数板、离心管等
二、实验步骤
bEnd.3细胞的培养与传代
- 复苏与培养：从液氮中取出冻存管，37℃水浴快速解冻，转移至含预温培养基的离心管中离心（250 g，3 min）。弃上清，重悬细胞后接种于T25培养瓶，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。
- 传代：当细胞融合度达95%左右时，吸弃旧培养基，PBS清洗2次。加入1 mL胰酶消化4分钟。加入1 mL完培终止消化，离心后按1:3比例传代。
- 注意事项：避免过度消化，防止细胞损伤。传代后每日观察细胞状态，确保无污染（培养基浑浊或pH异常）。
细胞种板（Transwell板）
- 消化细胞并计数，调整密度至5×10⁴ cells/mL（以完培重悬）。
- 取200μL细胞悬液接种于Transwell上室，下腔加入600μL完培，轻微晃动。
- 将Transwell板置于培养箱中，每隔48小时换液，培养5-8天至形成致密单层。
- 注意事项：种板后轻轻晃动Transwell板，以使细胞在上室膜均匀分布。种板时孔间细胞数量一致，减少孔间误差。换液时轻柔操作，避免液面剧烈晃动损伤细胞层。
TEER测量与屏障功能评估
- 测量准备：提前将TEER测量仪校准（空白电极调零）。将Transwell板从培养箱取出，室温平衡20分钟（减少温度波动对电阻的影响）。
- 测量步骤：将电极垂直浸入上腔和下腔培养基中，避免触碰膜表面。记录电阻值（Ω），每孔测量3次取平均值。计算公式：TEER (Ω·cm²) = (样品值 - 空白值) × 膜有效面积（cm²）（例：24孔板膜面积=0.33cm²）
- 屏障验证：TEER值≥### Ω·cm²表明屏障形成（参考值因实验室条件而异）。可辅助荧光素钠通透性实验验证单层完整性。
- 注意事项：测量时电极需严格消毒（75%酒精浸泡10分钟，PBS/完培冲洗）。若TEER值不稳定，需延长培养时间或检查细胞状态。
三、关键注意事项总结
- 无菌操作：全程超净台内完成，避免微生物污染。
- 细胞状态：使用低传代、高活力的细胞。
- TEER测量：避免电极触碰膜或气泡干扰，数据需扣除空白对照。
- 屏障验证：结合TEER与通透性实验（如荧光素钠渗透率）双重确认。
四、常见问题与解决方案
- TEER值过低：检查细胞密度和培养时间。
- 细胞单层不完整：优化接种密度或更换新鲜培养基。
- 测量值波动大：确保电极清洁及温度平衡，避免操作误差。
