bEnd.3细胞培养Protocol
一、细胞复苏
1. 预热与融解：将完全培养基（完培）于37℃水浴预热；从液氮或-80℃冰箱取出细胞，快速置于37℃水浴，晃动冻存管使冻存液均匀融化，避免水没过管盖以防污染。
2. 转移与离心：超净台内开盖，将细胞转移至离心管（可加等量完培），250 g或900 rpm/min离心3 min，弃上清，加1-2 mL完培轻柔吹打细胞沉淀，充分混匀（可计数）。
3. 接种培养：将细胞平均接种至1个T25培养瓶或培养皿（预先加3-5 mL完培），摇匀后放入培养箱。次日观察细胞状态（bEnd.3内皮细胞接种6 h后贴壁，减少开盖观察频率）。
二、细胞换液
1. 观察判断：细胞复苏/处理后第二天，显微镜观察细胞状态。若漂浮细胞过多，高倍镜判断死活：活细胞多则正常培养，死细胞多则换液。
2. 换液操作：弃上清，PBS润洗1-2次，添加预热完培继续培养。
3. 定期换液：每2-3天更换完培，后续根据细胞密度和状态传代或冻存。
三、细胞传代
1. 预热与处理：预热完培、PBS、0.25%胰酶-EDTA。弃培养瓶上清，PBS润洗1-2次，加胰酶覆盖细胞表面。
2. 消化终止：消化约3 min，轻拍瓶壁观察细胞脱离情况，立即加等体积完培终止消化，轻摇混匀。
3. 离心接种：吹打收集细胞悬液，250 g或900 rpm/min离心3 min，弃上清，加1-2 mL完培吹散。按1:2-1:3比例接种至培养瓶（T25瓶胰酶1 mL、完培3-5 mL；T75瓶胰酶2 mL、完培8-10 mL），摇匀培养。
四、细胞冻存
1. 准备细胞：细胞生长至密度90%-100%（T25瓶400-500万，T75瓶1200-1500万），消化后离心弃上清。
2. 重悬分装：用冻存液（8-10%血清+90-92%细胞级DMSO）重悬细胞，分装至冻存管，每管200-300万个细胞/mL。
3. 冻存程序：冻存管放入程序冻存盒，直接置-80℃冰箱；或“慢冻”：4℃ 10 min→-20℃ 2 h→-80℃冰箱。注意：细胞在-80℃冰箱保存不超过1-2天，需尽快转移至液氮。
